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全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
技術(shù)簡(jiǎn)介
基于Pacbio單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT），借助其超長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，無(wú)需組裝，直接獲得從5’末端到3’PolyA尾的高質(zhì)量的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息。利用全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，可獲取全長(zhǎng)mRNA序列，對(duì)基因異構(gòu)體、可變剪切、融合基因進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。
技術(shù)路線
送樣建議
濃度 (Qubit) | 總量 | 完整性及純度 | |
Total RNA | ≥300 ng/μL | ≥10 μg | RIN≥8.0，28S/18S≥1.3；基線平整，5S峰正常；OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8 |
測(cè)序策略 | 數(shù)據(jù)量 | 周期 | |
三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 | PacBio RS II | 15G data | 95 個(gè)自然日 |
案例分析
全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭秘玉米轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性[1]
研究背景
玉米（Zea mays）是全球重要的農(nóng)作物，也是研究植物轉(zhuǎn)錄組代謝通路的遺傳模型。玉米基因組序列于2009年公布，后續(xù)利用EST和RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其基因注釋進(jìn)行了補(bǔ)充。然而RNA-Seq中，短讀長(zhǎng)無(wú)法提供轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)序列，限制了可變剪接形式的鑒定等。
研究方法
采集玉米自交系B73不同發(fā)育階段的6個(gè)組織（根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗），提取mRNA，構(gòu)建6種插入片段文庫(kù)（<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 和>5 kb），進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和二代RNA-Seq測(cè)序（每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)）。
圖1. 新鑒定LncRNA分析
研究結(jié)果
測(cè)序得到的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列，其中有94.2%能夠比對(duì)到玉米RefGen_v3參考基因組上。經(jīng)聚類分析得到了來(lái)自53個(gè)家族（RefGen_v3總共57個(gè)）的新的isoform，對(duì)應(yīng)26,943個(gè)基因，轉(zhuǎn)錄因子5,423個(gè)，其中155個(gè)與生長(zhǎng)激素應(yīng)答功能相關(guān)。而鑒定的878個(gè)候選LncRNA中，867個(gè)（平均讀長(zhǎng)為1.1kb）為新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，具有結(jié)構(gòu)和組織特異性。進(jìn)一步對(duì)isoform、lncRNA和non-lncRNA區(qū)域進(jìn)行甲基化分析，發(fā)現(xiàn)non-lncRNA genes具有相對(duì)較高的CG甲基化水平，而lncRNAs具有相對(duì)較高的CHG甲基化水平，這些甲基化水平可能與玉米不同組織中基因的不同表達(dá)水平有關(guān)。
研究結(jié)論
PacBio超長(zhǎng)讀長(zhǎng)無(wú)需組裝即可得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息，相比于Illumina短讀長(zhǎng)組裝的isoform而言，更能直接準(zhǔn)確地獲得isoform信息，有助于解密玉米轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜的基因表達(dá)信息。
參考文獻(xiàn)
[1]. Wang B, Tseng E, Regulski M, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.
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